液相色譜柱的使用與維護

液相色譜(HPLC)是20世紀60年代后期發(fā)展起來(lái)的分離分析技術(shù)，是現代分離測定的重要手段。問(wèn)世以來(lái)，因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析高沸點(diǎn)但不能氣化的熱不穩定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析。液相色譜是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑，緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測樣品，由流動(dòng)相帶入柱內，在柱內各成分被分離后依次進(jìn)入檢測器，色譜信號由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。

色譜柱是液相色譜的心臟，在液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透粉性，延長(cháng)柱子的使用壽命非常重要。因此對液相色譜柱的維護是關(guān)鍵。

1 色譜柱的構造 
      色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70㎏/㎝2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經(jīng)過(guò)拋光。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或欽合金，孔徑0.2-20 μm(5-10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類(lèi)，尺寸規格也不同:

(I)常規分析柱(常量柱)，內徑2-5mm(常用4.6mm，國內有4mm和5mm )，柱長(cháng)10-30cm ;

(2)窄徑柱，又稱(chēng)細管徑柱、半微柱，內徑1 -2mm ,柱長(cháng)10-20cm;

(3)毛細管柱(又稱(chēng)微柱)，內徑0.2-0.5mm;

(4)半制備柱，內徑>5mm;

(5) 實(shí)驗室 制備柱，內徑20-40rnm，柱長(cháng)10-30cm;

(6)生產(chǎn)制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長(cháng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是為了避免管壁效應。

2色譜柱的使用和維護

在日常分離分析工作中，色譜柱的正確使用和維護十分重要，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會(huì )降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護色譜柱。

(1)柱子在裝卸、更換時(shí)，動(dòng)作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙。

(2)如果儀器用來(lái)做常規分析，樣品種類(lèi)有限，但分析次數多，則不妨為每一類(lèi)常規分析配置一根柱，這樣有助于延長(cháng)柱子的壽命。

(3)避免壓力和 溫度 的急劇變化及任何機械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì )影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì )沖動(dòng)柱內填料，因此在調節流速時(shí)應該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉動(dòng)不能過(guò)緩。

(4)應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?o:p>

(5)如使用柱溫控制裝置時(shí)，應注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。

(6)一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì )迅速降低柱效。

(7)選擇使用適宜的流動(dòng)相，以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

8)避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內，需要對樣品進(jìn)行預處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。

(9)經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統中流動(dòng)相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50-75mL。

(10)保存色譜柱時(shí)應將柱內充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過(guò)夜或更長(cháng)時(shí)間。

(11)色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時(shí)應更換濾片或將其取出進(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。

(12)在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時(shí)對色譜分析系統進(jìn)行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內的雜質(zhì)。

3色譜柱的再生

因為液相色譜柱是消耗品，隨著(zhù)使用時(shí)間或進(jìn)樣次數的增加，當出現色譜峰高陣低，峰寬加大或出現肩峰時(shí)，一般來(lái)說(shuō)可能是柱效下降。

(1 )反相柱的再，采用以甲醇:水=95: 5(V/V),純甲醇，二氯甲烷等溶劑作流動(dòng)相，順次沖洗，每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的量為2030倍色譜柱體積然后再以相反順序沖洗色譜柱。

(2)正相柱再生。順次以正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作流動(dòng)相沖洗色譜柱每步注意平衡溶劑的順序，不要顛倒每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的量為20-30倍柱體積(因異丙醇的粘度較大，沖洗過(guò)程中請隨時(shí)注意調整沖洗的流速)，用甲醇沖洗完后，再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必需嚴格脫水。

(3)離子交換柱的再生。長(cháng)時(shí)間在高pH值和高離子強度緩沖溶液中使用，將導致色譜柱離子交換能力降低。用稀酸緩沖溶液沖洗，可使陽(yáng)離子柱再生;反之，用稀堿緩沖溶液沖洗，可使陰離子柱再生。以上色譜柱的再生方法并不是的標準方法，使用者可根據自己的實(shí)際經(jīng)驗和目的，選擇合適的并能溶解柱內污染物的溶劑作流動(dòng)相，按正方向或反方向的沖洗。

但是需要指出是，無(wú)論采用什么方法再生色譜柱，均不可能*對復柱效或其他參數至新柱水平。

4色譜柱的發(fā)展方向

因強調分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(cháng)3-10cm，填料粒徑2-3 μm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱。細管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是:節省流動(dòng)相、靈敏度增加、樣品量少、能使用長(cháng)柱達到高分離度、容易控制柱溫、易于實(shí)現LC-MS聯(lián)用。

 

但由于柱體積越來(lái)越小，柱外效應的影響就更加顯著(zhù)，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能:輸液泵能情密輸出1-100μL/min的低流量，進(jìn)樣閥能準確、重復地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。