食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅲ——第二篇第三法

稱(chēng)取同一試樣兩份于 A、B 管中，加入氘代氯丙醇酯同位素內標，用氫氧化鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應，3 -氯- 1, 2-丙二醇酯（3-MCPDE）、2-氯-1, 3-丙二醇酯（2-MCPDE）和縮水甘油酯（GE）分別轉化為游離態(tài) 3-MCPD、2-MCPD、縮水甘油；試液經(jīng)中和、凈化和苯基硼酸衍生后，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

B 管樣品加入酸化溴化鈉溶液中和后，GE 水解生成的縮水甘油轉化為穩定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD），不影響氯丙醇酯的計算，B管用以測定試樣中 3-MCPDE、2-MCPDE 的含量；A 管樣品經(jīng)酸化氯化鈉溶液中和后，GE 水解后生成的縮水甘油主要轉化為 3-MCPD，測定得到的 3-MCPDE 值為試樣中 3-MCPDE 和縮水甘油酯（GE）之和，由 A 管和B 管 3-MCPDE 含量的差值，再乘以 3-MCPDE和GE 的折算系數，得到試樣中 GE 的含量。

實(shí)驗用到的標準品信息見(jiàn)下表：

表1 標準品信息

2.1 標準品溶液配置

氯丙醇酯混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE標準溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6個(gè)月。

氯丙醇酯混合標準工作液CaL I（2 μg/mL）：準確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混標中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

氯丙醇酯混合標準工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合標準工作液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

縮水甘油酯標準中間液（10 μg/mL）：準確移取1 mL 100 μg/mL 縮水甘油酯標準溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6個(gè)月。

縮水甘油酯標準工作液CaL I（2 μg/mL）：準確移取1 mL 10 μg/mL 縮水甘油酯標準中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

縮水甘油酯標準工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準確移取1 mL 2 μg/mL 縮水甘油酯標準工作液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

內標混合標準工作溶液（D5-3-MCPDE:1µg/mL，D5-2-MCPDE:1µg/mL）：分別準確移取0.2 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE和D5-2-MCPDE標準溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

2.2 標準曲線(xiàn)配制

按照下表所示，分別配制氯丙醇酯標準曲線(xiàn)和縮水甘油酯標準曲線(xiàn)。加入甲苯、叔丁基甲醚（tBME）、內標工作溶液和相應的混合標準工作溶液，按照“樣品前處理"進(jìn)行操作，上機檢測得到標準曲線(xiàn)。

表2 氯丙醇酯標準曲線(xiàn)的配制

（B管，加入酸性溴化鈉）

表3 縮水甘油酯標準曲線(xiàn)的配制

（A管，加入酸性氯化鈉）

標準品配制注意事項：

1、氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計，定量計算中需特別注意。

2、如使用純品型標品，需注意計算標品的純度和對應的折算系數。建議選擇安譜璀世溶液型標品，進(jìn)行稀釋配制，操作更加方便。

3、注意區分AB管，氯丙醇酯標曲加入溴化鈉溶液，縮水甘油酯標曲加入氯化鈉溶液；內標混合標準工作溶液均需要加入。

試劑配置：

硫酸水溶液（25%）：將25 mL硫酸轉移至含有50 mL純水的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線(xiàn)并混勻。

酸性溴化鈉水溶液（600 g/L）：稱(chēng)取 60 g溴化鈉，加水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，加入3.5 mL 25%硫酸溶液，用水定容至刻度，混勻。

酸化氯化鈉水溶液（200 g/L）：稱(chēng)取 20 g 氯化鈉，加水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，加入3.5 mL 25%硫酸溶液，用水定容至刻度，混勻。

氫氧化鈉-甲醇溶液（0.35 mol/L）：稱(chēng)取1.4 g氫氧化鈉，加入甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，轉移至塑料瓶中，儲存于10℃下。臨用現配。

苯硼酸溶液：稱(chēng)取適量苯基硼酸，溶于無(wú)水乙_醚，配制成飽和溶液，混勻。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各 100 mL，混勻。

乙_醚-乙酸乙酯溶液（6+4）：量取 60 mL 乙_醚和 40 mL 乙酸乙酯，混勻。

1%乙二醇溶液：移取 100 µL乙二醇，加乙酸乙酯定容至 10 mL，混勻。

試樣提?。?/strong>

準確稱(chēng)取兩份嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至 1 mg）于兩支40 mL玻璃螺紋樣品瓶中（A、B管），分別準確加入100 µL混合內標工作液（1 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，渦旋混勻，再加入1 mL氨水，蓋塞渦旋混勻，在65℃±5℃水浴下振蕩30 min，取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇，渦旋后加入5 mL乙_醚，振搖5 min，然后加入5 mL石油醚，繼續振搖5 min。待溶液靜置分層后，取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重復萃取1次，合并有機相于40 ℃下氮吹濃縮至干，用2 mL乙_醚-石油醚溶液（1+1）淋洗樣品瓶?jì)缺?，將洗液轉移至8 mL玻璃螺紋樣品瓶中，于40 ℃下氮吹至干，供堿水解。

堿水解（酯鍵斷裂反應）：

向提取脂肪樣品中加入100 µL甲苯、200 µL叔丁基甲醚（tBME）。渦旋混勻30 s，10°C水浴冷卻7 min。加入200 µL于10℃±1℃下冷卻好的 0.35 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，渦旋混勻，于10℃±1℃下水解反應7 min。結束后立即于A(yíng)管、B管中分別加入酸化氯化鈉溶液、酸化溴化鈉溶液各600 µL終止水解反應，渦旋，放置5 min。

于上述A、B管中和后的水解液中各加入600 µL正己烷，渦旋30 s后，靜置待分層后棄去正己烷液，再加入正己烷重復萃取一次。若分層不理想，可以2000 r/min的速度離心3 min，下層水相供衍生用。

試樣凈化：

在凈化的水溶液中加入0.5 mL無(wú)水乙_醚-乙酸乙酯（6+4），渦旋10 s，取上層溶液于裝有約0.3 g無(wú)水硫酸鈉的離心管中，渦旋，再加入0.5 mL無(wú)水乙_醚-乙酸乙酯（6+4）重復萃取操作。

衍生化反應：

合并2次萃取液，向凈化液中加入30 µL苯基硼酸溶液，渦旋30 s后，加入30 µL 1%乙二醇溶液，渦旋，靜置分層，必要時(shí)可離心使分層徹_底，將溶液轉移至裝有約0.3 g無(wú)水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中，渦旋混勻10 s，提取液過(guò)0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。

前處理注意事項：

1、0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下，建議至少存放2h以上，臨用前拿出；

2、10°C低溫酯交換反應時(shí)需盡量將整個(gè)螺紋瓶浸泡在水中，以保證螺紋瓶?jì)葴囟确€定；

3、前處理過(guò)程中盡量避免使用塑料耗材，可使用玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動(dòng)進(jìn)樣針等耗材，建議進(jìn)行方法空白實(shí)驗監控過(guò)程本底情況；

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進(jìn)行過(guò)濾；

5、注意區分AB管，B管加入溴化鈉溶液用于檢測3-MCPDE和2-MCPDE的含量，A管加入氯化鈉溶液用于校正計算GE的含量。

儀器維護注意事項：

1、隨著(zhù)進(jìn)樣次數的增加，儀器輕微污染，目標物保留時(shí)間可能發(fā)生偏移；

2、該實(shí)驗對儀器污染比較嚴重，儀器受到嚴重污染后，可能導致目標物響應降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護，包括進(jìn)樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

3、如儀器配制程序升溫進(jìn)樣口和反沖功能，可明顯降低對儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m 相同固定相的預柱，定期對預柱進(jìn)行更換，可延長(cháng)色譜柱的使用壽命。

6.1 標準曲線(xiàn)數據

在加入酸性溴化鈉溶液的B管標準樣品中，以氯丙醇酯的質(zhì)量(以醇計)為橫坐標，以氯丙醇酯與其對應內標的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。

在加入酸性氯化鈉溶液的A管標準樣品中，計算 3-MCPD 與內標 D5-3-MCPD 的峰面積比值，通過(guò) 3-MCPD 的標準工作曲線(xiàn)（B管標準樣品得到）計算得到A管標液中 3-MCPD（由縮水甘油酯標品轉變而來(lái)）的質(zhì)量。以 GE 的質(zhì)量（以縮水甘油計）為橫坐標，GE 轉化后形成的 3-MCPD的質(zhì)量為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)，標準曲線(xiàn)斜率的倒數（1/a）即為 3-MCPD 增加量折算成 GE 含量的系數t。

表5 標準曲線(xiàn)

6.2 加標回收率數據

本次實(shí)驗方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯，奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.040、0.024、0.006 mg/kg。

奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的加標回收率數據見(jiàn)下表。

表6 奶粉基質(zhì)的加標回收率數據（n=3）

數據計算注意事項：

1、本實(shí)驗3-氯丙醇酯使用D5-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量?jì)葮耍?-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量?jì)葮耍?/p>

2、縮水甘油酯最終含量以縮水甘油計，因此其含量不是簡(jiǎn)單的A、B管的3-MCPD差值，需要乘以折算系數；

3、基質(zhì)樣品通常含有本底，回收率均為扣除本底后計算得到。

使用安譜實(shí)驗標準品和相關(guān)耗材，參照國標《GB 5009.191-2024 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第三法，堿水解方法，使用氘代同位素內標法進(jìn)行定量，AB雙樣校準縮水甘油酯含量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在85%-110%之間，RSD小于10%。該方法操作簡(jiǎn)便快速，能夠很好的滿(mǎn)足奶粉基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。