食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅱ—— GB 5009.191-2024

在酸性溴化鹽溶液中，3-氯丙醇酯轉化為3-氯丙二醇（3-MCPD）單酯、2-氯丙醇酯轉化為2-氯丙二醇（2-MCPD）單酯、縮水甘油酯轉化為3-溴丙二醇（3-MBPD）單酯。隨后，在酸性甲醇溶液中3-MCPD酯、2-MCPD酯和3-MBPD酯轉化為氯丙醇和溴丙醇，酸水解得到的溶液經(jīng)碳酸氫鈉溶液中和后，通過(guò)硅藻土小柱進(jìn)行凈化，使用七氟丁?；溥驅?-MCPD、2-MCPD及3-MBPD進(jìn)行衍生，氣相色譜-質(zhì)譜檢測，內標法定量。

實(shí)驗用到的標準品信息見(jiàn)下表：

表1 標準品信息

2.1 標準品溶液配置

氯丙醇酯、縮水甘油酯混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE、GE標準溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20℃保存，保存期6個(gè)月。

氯丙醇酯、縮水甘油酯混合標準工作液CaL I（2 μg/mL）：準確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯縮水甘油酯混合標準中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

氯丙醇酯、縮水甘油酯混合標準工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯縮水甘油酯混合標準中間液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

內標混合標準工作溶液（D5-3-MCPDE:2µg/mL，D5-2-MCPDE:2µg/mL，D5-GE：2µg/mL）：分別準確移取0.4 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE標準溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

2.2 標準曲線(xiàn)配制

配制氯丙醇酯和縮水甘油酯標準曲線(xiàn)，取 5 支 8 mL玻璃螺紋樣品瓶中，分別加入 2 mL 四氫呋喃，再準確加入 100 μL 混合內標工作液（2.00 µg/mL），渦旋混勻后，按照下表加入混合標準工作溶液，按照“樣品前處理"進(jìn)行后續操作，上機檢測得到標準曲線(xiàn)。

表2 氯丙醇酯、縮水甘油酯標準曲線(xiàn)的配制

標準品配制注意事項：

1、氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計，定量計算中需特別注意。

2、如使用純品型標品，需注意計算標品的純度和對應的折算系數。建議選擇安譜璀世溶液型標品，進(jìn)行稀釋配制，操作更加方便。

試劑配置：

0.7%酸性溴化鈉溶液：稱(chēng)取1.0 g溴化鈉，加入10 mL水溶解，混勻；從中取出1.0 mL，加入1.0 mL硫酸和12 mL水，混勻，有效期1個(gè)月。

碳酸氫鈉溶液（0.6%）：稱(chēng)取0.6 g碳酸氫鈉。加入80 mL純水，溶解后轉移至100 mL容量瓶中，純水定容至100 mL，臨用現配。

飽和碳酸氫鈉溶液（9.6%）：稱(chēng)取9.6 g碳酸氫鈉。加入100 mL純水，加熱溶解后，降至室溫，溶液中存在沉淀，臨用現配。

硫酸-甲醇（1.8%）：吸取1.8 mL硫酸于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，建議臨用現配。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各100 mL，混勻。

試樣提?。?/strong>

準確稱(chēng)取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至1 mg）于40 mL玻璃螺紋樣品瓶中，準確加入100 µL混合內標工作液（2 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，渦旋混勻，再加入1 mL氨水，蓋塞渦旋混勻，在65℃±5℃水浴下振蕩30 min，取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇，渦旋后加入5 mL乙_醚，振搖5 min，然后加入5 mL石油醚，繼續振搖5 min。待溶液靜置分層后，取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重復萃取1次，合并有機相于40℃下氮吹濃縮至1mL左右，待凈化。

脂肪的凈化：

將上述待凈化溶液轉移至活化后的氨基固相萃取柱【SBEQ-CA2154，500 mg/6 mL 小柱臨用前用6mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)溶液活化】中，加入12mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)溶液洗脫，收集全部流出液及洗脫液，于40 ℃下氮吹至干，供溴代反應。

溴代反應和酸水解：

向提取樣品中加入2 mL四氫呋喃，渦旋混勻后，再加入30 μL 0.70%酸化溴化鈉溶液，混勻后，于50℃下放置15 min進(jìn)行溴代反應。結束后加入3 mL 0.60%碳酸氫鈉溶液中和，渦旋30 s。加入3 mL正己烷萃取，充分渦旋，靜置待溶液分層后，取上層溶液在40℃下氮吹至干，加入1 mL四氫呋喃復溶。

于上述復溶溶液中加入1.8 mL 1.8%硫酸-甲醇溶液，渦旋混勻，于40℃下水解約16 h，結束后加入0.50 mL 9.6%碳酸氫鈉溶液中和，渦旋，將溶液在40 ℃下氮吹至體積為1 mL~1.5 mL；溶液供凈化。

試樣凈化：

將上述中和后的水解液全部轉移至硅藻土小柱（SBEQ-CA3918-MCPD，5 g/60 mL）上，放置10 min，然后用25 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，再用35 mL二氯甲烷洗脫。

收集洗脫液，加入10 g脫水劑（無(wú)水硫酸鈉和無(wú)水硫酸鎂各5 g），溶液放置至少30 min，期間不時(shí)振搖4次~5次，以徹_底脫水；將溶液轉移至40 mL玻璃螺紋樣品瓶中，于40℃水浴氮吹濃縮至約0.5 mL，將濃縮液轉移至20 mL頂空瓶中，用2 mL正己烷分兩次淋洗螺紋瓶?jì)缺?，洗液一并轉入頂空瓶中，待衍生。

衍生化反應：

于凈化后濃縮液中，用氣密針快速加入0.05 mL七氟丁?；溥?，立即壓蓋，渦旋30 s后，于70 ℃保溫20 min。衍生結束后取出頂空瓶，冷卻至室溫，加入2 mL 20%氯化鈉溶液，充分渦旋使上層溶液澄清，靜置使水相和正己烷分層，取上層溶液至裝有約0.3 g無(wú)水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中，渦旋混勻10 s，提取液過(guò)0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。

前處理注意事項：

1、前處理過(guò)程中盡量避免使用塑料耗材，可使用玻璃小柱、玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動(dòng)進(jìn)樣針等耗材，建議進(jìn)行方法空白實(shí)驗監控過(guò)程本底情況；

2、七氟丁?；溥蛞孜?，建議低溫干燥保存（可放于含有干燥劑的袋子中然后置于冰箱保存），建議臨用前從冰箱拿出；

3、衍生反應需在密閉性良好的帶蓋玻璃管中進(jìn)行，建議使用頂空瓶進(jìn)行；

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進(jìn)行過(guò)濾。

儀器維護注意事項：

1、隨著(zhù)進(jìn)樣次數的增加，儀器輕微污染，目標物保留時(shí)間可能發(fā)生偏移；

2、該實(shí)驗對儀器污染比較嚴重，儀器受到嚴重污染后，可能導致目標物響應降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護，包括進(jìn)樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

3、如儀器配制程序升溫進(jìn)樣口和反沖功能，可明顯降低對儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m 相同固定相的預柱，定期對預柱進(jìn)行更換，可延長(cháng)色譜柱的使用壽命。

6.1 標準曲線(xiàn)數據

以標準品與內標的質(zhì)量為橫坐標，目標物與其對應內標的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。3-MCPDE、2-MCPDE、GE的標準曲線(xiàn)和相關(guān)系數見(jiàn)下表：

表4  3-MCPDE、2-MCPDE、GE的標準曲線(xiàn)

6.2 加標回收率數據

本次實(shí)驗方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯，奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.028、0.013、0.007 mg/kg。

奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的加標回收率數據見(jiàn)下表。

表5  奶粉基質(zhì)的加標回收率數據（n=3）

數據計算注意事項：

1、本實(shí)驗3-氯丙醇酯使用D5-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量?jì)葮耍?-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量?jì)葮?；縮水甘油酯使用D5-縮水甘油棕櫚酸酯作為定量?jì)葮?；酸水解方法? -氯- 1, 2-丙二醇酯不會(huì )轉換成縮水甘油（Gly），因此不影響縮水甘油酯含量的計算。

使用安譜實(shí)驗標準品和相關(guān)耗材，參照國標《GB 5009.191-2024 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第二法，對酸水解方法，使用同位素內標法進(jìn)行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之間，RSD小于13%。該方法操作簡(jiǎn)便，最然時(shí)間較長(cháng)，但縮水甘油酯含量不受氯丙醇轉換影響，方便理解。安譜實(shí)驗標準品和相關(guān)耗材能夠很好的滿(mǎn)足奶粉基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。