食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

試樣中加入同位素內標，用氫氧化鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應，3 -氯- 1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯和縮水甘油酯分別轉化為游離態(tài)3 -氯- 1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、縮水甘油（Gly）和相應的脂肪酸甲酯；以酸性溴化鈉溶液進(jìn)行中和，生成的縮水甘油轉化為穩定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）；試液經(jīng)凈化去除脂肪酸甲酯等雜質(zhì)后，進(jìn)行苯基硼酸衍生，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，內標法定量。

酯鍵斷裂反應中，生成的游離態(tài)3-MCPD在堿性條件下會(huì )部分轉化成縮水甘油，經(jīng)酸性溴化鈉溶液作用生成3-MBPD；同位素13C3-3-MCPD在相同條件下轉化成13C3-3-MBPD的比例和3-MCPD轉化成3-MBPD的比例一致，通過(guò)轉換關(guān)系對試液中總縮水甘油含量進(jìn)行修正，得到試樣中縮水甘油酯含量。

實(shí)驗用到的標準品信息見(jiàn)下表：

表1 標準品信息

2.1 標準品溶液配置

氯丙醇酯混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE標準溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6個(gè)月。

氯丙醇酯混合標準工作液CaL I（2 μg/mL）：準確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混標中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

氯丙醇酯混合標準工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合標準工作液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

縮水甘油酯標準中間液（10 μg/mL）：準確移取1 mL 100 μg/mL 縮水甘油酯標準溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6個(gè)月。

縮水甘油酯標準工作液CaL I（2 μg/mL）：準確移取1 mL 10 μg/mL 縮水甘油酯標準中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

縮水甘油酯標準工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準確移取1 mL 2 μg/mL 縮水甘油酯標準工作液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

內標混合標準工作溶液（13C3-3-MCPDE:2µg/mL，D5-2-MCPDE:2µg/mL，D5-GE：2µg/mL）：分別準確移取0.4 mL 50 μg/mL 13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE標準溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3個(gè)月。

2.2 標準曲線(xiàn)配制

按照下表所示，分別配制氯丙醇酯標準曲線(xiàn)和縮水甘油酯標準曲線(xiàn)。加入甲苯、叔丁基甲醚（tBME）、內標工作溶液和相應的混合標準工作溶液，按照“樣品前處理"進(jìn)行操作，上機檢測得到標準曲線(xiàn)。

表2 氯丙醇酯標準曲線(xiàn)的配制

表3 縮水甘油酯標準曲線(xiàn)的配制

標準品配制注意事項：

1、氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計，定量計算中需特別注意。

2、如使用純品型標品，需注意計算標品的純度和對應的折算系數。建議選擇安譜璀世溶液型標品，進(jìn)行稀釋配制，操作更加方便。

3、為確定反應過(guò)程中3-MCPD在轉化成縮水甘油的含量，本方法需要分別配制氯丙醇酯和縮水甘油酯兩組標準曲線(xiàn)，但內標為同位素標記，可以不進(jìn)行分開(kāi)配制，將13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE三者混合使用。

試劑配置：

硫酸水溶液（25%）：將25 mL硫酸轉移至含有50 mL純水的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線(xiàn)并混勻。

酸性溴化鈉溶液（溴化鈉600 g/L）：將60 g溴化鈉溶解于70 mL純水中。將溴化鈉溶液轉移至含有3.5 mL 25%硫酸溶液的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線(xiàn)并混勻。

氫氧化鈉-甲醇溶液（0.35 mol/L）：稱(chēng)取1.4 g 氫氧化鈉，加入甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，轉移至塑料瓶中，儲存于10℃下。臨用現配。

苯硼酸溶液：稱(chēng)取12.0 g苯硼酸，加入100 mL的95%丙酮水溶液，混勻。溶液可在室溫下儲存三個(gè)月。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各100 mL，混勻。

1%乙二醇溶液：移取 100 µL乙二醇，加水定容至10 mL，混勻。

試樣提?。?/strong>

準確稱(chēng)取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至1 mg）于40 mL玻璃螺紋樣品瓶中，準確加入100 µL混合內標工作液（2 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，渦旋混勻，再加入1 mL氨水，蓋塞渦旋混勻，在65℃±5℃水浴下振蕩30 min，取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇，渦旋后加入5 mL乙_醚，振搖5 min，然后加入5 mL石油醚，繼續振搖5 min。待溶液靜置分層后，取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重復萃取1次，合并有機相于40℃下氮吹濃縮至干，用2 mL乙_醚-石油醚溶液（1+1）淋洗樣品瓶?jì)缺?，將洗液轉移至8 mL玻璃螺紋樣品瓶中，于40 ℃下氮吹至干，供堿水解。

堿水解（酯鍵斷裂反應）：

向提取樣品中加入100 µL甲苯、200 µL叔丁基甲醚（tBME）。渦旋混勻30 s，10°C水浴冷卻6 min。

加入預冷的200 µL氫氧化鈉-甲醇溶液（0.35 mol/L），渦旋混勻10 s，繼續10°C水浴7 min進(jìn)行酯鍵斷裂反應。然后加入600 µL酸化溴化鈉水溶液（溴化鈉600 g/L），渦旋混勻10 s，停止反應。讓溫度穩定在室溫靜置至少5 min，以使所有縮水甘油完_全轉化為3-MBPD。

試樣凈化：

在樣品中加入600 µL異辛烷，渦旋混勻10 s，取出上層有機相，棄去。再加入600 µL異辛烷，渦旋10 s，然后取出上層有機相，棄去，注意不要取到任何水層。

衍生化反應：

向凈化液中加入100 µL苯基硼酸溶液，渦旋30 s后，加入100 µL 1%乙二醇溶液和1.0 mL異辛烷，渦旋，靜置分層，必要時(shí)可離心使分層徹_底，取上層溶液至裝有約0.3 g無(wú)水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中，渦旋混勻10 s，提取液過(guò)0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。

前處理注意事項：

1、0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下，建議至少存放2h以上，臨用前拿出；

2、10°C低溫酯交換反應時(shí)需盡量將整個(gè)螺紋瓶浸泡在水中，以保證螺紋瓶?jì)葴囟确€定；

3、前處理過(guò)程中盡量避免使用塑料耗材，可使用玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動(dòng)進(jìn)樣針等耗材，建議進(jìn)行方法空白實(shí)驗監控過(guò)程本底情況；

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進(jìn)行過(guò)濾；

5、前處理過(guò)程中會(huì )存在3 -氯- 1, 2-丙二醇酯轉換生成的縮水甘油（Gly）的副反應，在上述條件下，13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯（13C3-3-MCPD-PP）轉換為13C3-Gly的轉換率需控制在10%左右，如轉換率過(guò)高需排查前處理過(guò)程，轉化率偏高的主要原因可能是溫度控制不理想導致；

6、在上述條件下，2-MCPD可轉化為縮水甘油的比率<1%，可以忽略不計。

儀器維護注意事項：

1、隨著(zhù)進(jìn)樣次數的增加，儀器輕微污染，目標物保留時(shí)間可能發(fā)生偏移；

2、該實(shí)驗對儀器污染比較嚴重，儀器受到嚴重污染后，可能導致目標物響應降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護，包括進(jìn)樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

3、如儀器配制程序升溫進(jìn)樣口和反沖功能，可明顯降低對儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m相同固定相的預柱，定期對預柱進(jìn)行更換，可延長(cháng)色譜柱的使用壽命。

6.1 標準曲線(xiàn)數據

以標準工作液中標準品的質(zhì)量（以醇計）為橫坐標，以標準品與對應內標的峰面積比為縱坐標，繪制3-MCPDE、2-MCPDE 和 GE 的標準曲線(xiàn)，標準曲線(xiàn)見(jiàn)表5。

以氯丙醇酯標準系列衍生液中 3-MCPD 與13C3-3-MCPD 的峰面積比為橫坐標，3-MBPD 與13C3-3-MBPD 的峰面積比為縱坐標，繪制 3-MCPD 轉化為 3-MBPD 的標準曲線(xiàn)，用于計算試液中 3-MCPDE水解產(chǎn)物 3-MCPD 轉化為 3-MBPD 的峰面積，標準曲線(xiàn)見(jiàn)表5。

表5 標準曲線(xiàn)

6.2 加標回收率數據

本次實(shí)驗方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯，奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.033、0.019、0.008 mg/kg，其中縮水甘油酯含量的計算已經(jīng)校正了3 -氯- 1,2-丙二醇酯的轉換影響。

樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率數據見(jiàn)下表。

表6 奶粉基質(zhì)的加標回收率數據（n=3）

數據計算注意事項：

1、本實(shí)驗3-氯丙醇酯使用13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量?jì)葮耍?-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量?jì)葮?；縮水甘油酯使用D5-縮水甘油棕櫚酸酯作為定量?jì)葮耍?/p>

2、縮水甘油酯是通過(guò)前處理轉換為 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）進(jìn)行上機檢測；

3、樣品中縮水甘油酯GE的計算需扣除3 -氯- 1, 2-丙二醇酯轉換生成的縮水甘油（Gly）的影響，轉換量（GE 的高估值）需要通過(guò)試液中 3-MCPD 轉化而成的 3-MBPD 的峰面積A1進(jìn)行計算，而A1需要通過(guò)3-MCPD 轉換 3-MBPD 的標準曲線(xiàn)進(jìn)行計算得到。計算中需注意不同計算目的的內標選擇。

4、樣品中氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計，計算中需特別注意。

使用安譜實(shí)驗標準品和相關(guān)耗材，參照國標《GB 5009.191-2024 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第一法，快速堿水解方法，使用同位素內標法進(jìn)行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之間，RSD小于11%。該方法操作簡(jiǎn)便，快速，穩定，能夠很好的滿(mǎn)足奶粉基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。