干貨丨維生素E異構體分離，你想要的全在這里！

首先我們看一下4種維生素E的結構（如圖1.1），對于反相分離模式，我們通常從極性差異來(lái)判斷能否分離，從非極性看，α-生育酚>β-生育酚≈γ-生育酚>δ-生育酚，用常規C18色譜柱，意料之中，β-生育酚和γ-生育酚由于非極性差異太小，不能實(shí)現分離（如圖1.2）。

圖1.1  維生素E結構式

圖1.2  C18分離4種維生素E異構體譜圖

同樣屬于反相分離模式，為什么C30色譜柱可以實(shí)現2種物質(zhì)的分離呢（譜圖見(jiàn)后續二、三、四部分）？

首先我們看下C30色譜柱，和C18色譜柱相比，烷基鏈更長(cháng)，由于填料的孔徑都是約為120Å，孔表面鍵合的烷基鏈越長(cháng)，不同位置鍵合的烷基鏈交叉重疊的可能性增大，待測組分通過(guò)孔內的阻力增大，C30分離β-生育酚和γ-生育酚依靠的是空間位阻作用。

2.1 流速的影響

色譜條件：

色譜柱：Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)

柱溫：20℃

流速：0.8ml/min

進(jìn)樣量：10μl

紫外檢測波長(cháng)：維生素E為294nm

流動(dòng)相：A：甲醇     B：水

測試結果：

按照GB5009.82-2016第一法中色譜條件，我們發(fā)現β-生育酚拖尾，為了排查β-生育酚拖尾原因，首先嘗試將流速調為0.9ml/min，β-生育酚不拖尾，在27.8min附近多一個(gè)鼓包，干擾α-生育酚的定量，不進(jìn)樣走流動(dòng)相，也有該鼓包，說(shuō)明是流動(dòng)相梯度混合產(chǎn)生的基線(xiàn)波動(dòng)，流速為0.8ml/min時(shí)，基線(xiàn)鼓包和β-生育酚出峰接近，造成β-生育酚拖尾。繼續增大流速至1.0ml/min，目標物出峰時(shí)間提前，α-生育酚和基線(xiàn)鼓包可以分開(kāi)。

按照GB5009.82-2016第一法中色譜條件，采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)，通過(guò)增大流速，可以避免基線(xiàn)波動(dòng)對目標峰的干擾，另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。具體結果見(jiàn)表2.1。

表2.1 不同流速條件的結果分析

2.2 流動(dòng)相的影響

既然上述條件，β-生育酚“拖尾”是由于梯度程序造成，考慮到整個(gè)梯度程序流動(dòng)相的組成差異很小，我們直接采用甲醇為流動(dòng)相，也可以避免基線(xiàn)鼓包造成的峰形差等干擾。

總結：

該案例中的“峰形差”是梯度流動(dòng)相梯度混合產(chǎn)生的基線(xiàn)波動(dòng)造成的假象，通過(guò)增大流速或者將流動(dòng)相調為甲醇即可解決。

3.1 流速的影響

參考表2.1，增大流速后可以避免基線(xiàn)波動(dòng)對目標峰的干擾，另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。流速是怎么影響β-生育酚和γ-生育酚分離度的呢？還是要從分離度的計算公式來(lái)看，

增大流速后，由于色譜柱和流動(dòng)相種類(lèi)沒(méi)有變化，選擇性α保持不變，由于整個(gè)梯度程序，流動(dòng)相的組成變化不大，所以k變化較小，而β-生育酚和γ-生育酚的柱效提高，所以分離度得到改善。

3.2 柱溫的影響

采用甲醇為流動(dòng)相時(shí)，參考2.2中結果，β/γ-生育酚的分離度只有1.55，勉強達到基線(xiàn)分離，我們嘗試將柱溫降低為15℃，β-生育酚和γ-生育酚的分離度明顯得到改善，達到1.90。

柱溫是怎么影響分離度的呢？柱溫的影響相對比較復雜，它對柱效、選擇性和保留因子都有影響，從而對分離度產(chǎn)生影響，這里就不詳細分析柱溫對每個(gè)參數的影響程度了。這個(gè)案例說(shuō)明β/γ-生育酚的分離對柱溫比較敏感，遇到分離度的問(wèn)題時(shí)可以考慮降低柱溫。

總結：

β-生育酚和γ-生育酚分離不理想，梯度條件，可以通過(guò)增大流速解決，甲醇做流動(dòng)相等度條件下，可以通過(guò)降低柱溫解決。

我們發(fā)現，用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN: LAEQ-462552)，粒徑從3 μm增大為5 μm，在滿(mǎn)足分離度的前提下，系統壓力更低哦，見(jiàn)表3.1。

表3.1 不同色譜條件下的對比

總結：

采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流動(dòng)相，可以實(shí)現更優(yōu)的結果，α-生育酚出峰時(shí)間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。

5.1 遇到“峰形差”問(wèn)題，首先排查是否流動(dòng)相的影響，可以通過(guò)空走流動(dòng)相來(lái)確認，該案例中的“峰形差”是梯度流動(dòng)相梯度混合產(chǎn)生的基線(xiàn)波動(dòng)造成的假象，通過(guò)增大流速或者將流動(dòng)相調為甲醇即可解決。

5.2 β-生育酚和γ-生育酚分離不理想，梯度條件，可以通過(guò)增大流速解決，甲醇做流動(dòng)相等度條件下，可以通過(guò)降低柱溫解決。

5.3 采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流動(dòng)相，可以實(shí)現更優(yōu)的結果，α-生育酚出峰時(shí)間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。