干貨丨合成著(zhù)色劑分析之赤蘚紅分析回收率不穩定？安譜實(shí)驗帶你揭秘真相！

之前我們曾探討過(guò)亮藍分析有雜峰干擾的原因和靛藍分析回收率不穩定的原因，亮藍分析有雜峰干擾是因為亮藍存在3個(gè)同分異構體，靛藍回收率不穩定是因為溫度、光照、時(shí)間等因素會(huì )影響靛藍溶液的穩定性。

關(guān)于合成著(zhù)色劑的分析我們有一系列的小知識想和大家分享，今天為大家帶來(lái)的是關(guān)于赤蘚紅分析時(shí)回收率不穩定的原因。

本文所指的赤蘚紅，CAS是16423-68-0，我們稱(chēng)之為赤蘚紅是參考《GB 5009.35-2016 食品安全guo家標準 食品中合成著(zhù)色劑的測定》，在某些文獻資料中大家可能會(huì )看到將CAS是16423-68-0的物質(zhì)稱(chēng)之為赤蘚紅B，主要由于俗稱(chēng)的問(wèn)題。網(wǎng)上搜索赤蘚紅，你一定會(huì )搜索到兩個(gè)不同CAS的化合物，還有一個(gè)CAS號是568-63-8，通過(guò)比較化學(xué)式，可以看出這兩個(gè)化合物互為同分異構體。CAS號是化合物的身fen證，是化合物的唯yi標示，在合成著(zhù)色劑分析時(shí)受俗稱(chēng)的影響，很容易選錯分析對象，建議大家在選購合成著(zhù)色劑的時(shí)候，一定要將CAS號作為唯yi標識。

CAS：16423-68-0 

CAS：568-63-8

在GB 5009.35中有一種合成著(zhù)色劑的提取方法：聚酰胺吸附法。在操作的時(shí)候很不方便，目前已經(jīng)有商品化的聚酰胺固相萃取小柱代替，比如安譜實(shí)驗的CNW Poly-sery PA 聚酰胺小柱，因其操作方便、節省時(shí)間、節省試劑、對多種合成著(zhù)色劑處理后結果準確且回收率高，因而備受廣大消費者的青睞，將其用于8種合成著(zhù)色劑的前處理實(shí)驗過(guò)程和結果如下文所示。

SPE

小柱：CNW Poly-sery PA 聚酰胺小柱  （500mg/6mL）

活化：5mL甲醇

平衡：5mL 水

上樣：5mL 1ppm 8種合成著(zhù)色劑標準品，溶劑檸檬酸溶液（pH 3.0~4.0）

淋洗：5mL 甲醇：甲酸：去離子水（4：2：4）（V/V/V），淋洗后抽干小柱中的溶液

洗脫：3mL*2 10%氨水甲醇

收集洗脫液，并于50℃氮吹至干，用甲醇：0.02M乙酸銨溶液（1:1）定容至1mL，充分溶解后，上機分析。

儀器條件

色譜柱： C18-Wp（4.6mm*250mm，5um）

流動(dòng)相：A:甲醇B：0.02M乙酸銨

梯度洗脫：0min 15%A，5min 35% A，12~22min 95%A，22.5~30min 15 %A

流速：1.0mL/min

柱溫：25℃

波長(cháng)：254nm

進(jìn)樣量：10ul

實(shí)驗結果

表1 8種合成著(zhù)色劑實(shí)驗結果

結果表明，除赤蘚紅之外，其他7種合成著(zhù)色劑的回收率均大于90%，RSD小于5%，赤蘚紅回收率較低，且多次實(shí)驗發(fā)現其回收率在70%~90%之間，回收率不穩定。

原因分析

那么到底是什么原因導致赤蘚紅回收率不穩定呢。仔細閱讀國標，可以發(fā)現對于含赤蘚紅的樣品，其提取方法采用的是液液——分配法，而非聚酰胺吸附法，但是國標并沒(méi)有對赤蘚紅為何不能采用聚酰胺吸附法做解釋說(shuō)明。結合赤蘚紅的化學(xué)結構和GB 5009.35我們來(lái)分析一下原因。

液-液分配法原理，加鹽酸使赤蘚紅結構上的Na反應后變?yōu)镠，赤蘚紅分子上的酚羥基與三正辛胺分子中的氮原子形成氫鍵，生成不溶于水的化合物，被萃取到正丁醇中，加飽和硫酸鈉去除有機相中殘留的水分，正己烷去除油脂類(lèi)雜質(zhì)，用氨水做反萃溶劑，加入氨水，使化合物的氫鍵斷裂，赤蘚紅進(jìn)入水相，乙酸調pH至中性，濃縮后待測。

聚酰胺吸附法的原理，聚酰胺是由酰胺鍵聚合形成的高分子化合物，其酰胺基可與羥基酚類(lèi)、酸類(lèi)、醌類(lèi)、硝基等化合物以氫鍵形式結合而被吸附。其他7種合成著(zhù)色劑均含有較多的磺酸鈉基團，在酸性條件下轉變成磺酸根，與聚酰胺的結合很緊密，甲醇-甲酸溶液并不能使其分離，可以作為淋洗溶劑，淋洗掉一些雜質(zhì)，加水也不能將其分離，同時(shí)可以洗去一些水溶性雜質(zhì)，加入乙醇-氨水-水，將合成著(zhù)色劑解析出來(lái)，乙酸調pH至中性，濃縮后待測。SPE的方法也是利用了此原理，酸性條件上樣，使目標物與聚酰胺結合，再用一定比例的甲醇：甲酸：去離子水淋洗去除雜質(zhì)，然后用氨水甲醇洗脫掉目標物，濃縮復溶待測。所以這7種合成著(zhù)色劑用聚酰胺粉和聚酰胺小柱均能得到較好的結果。而赤蘚紅在酸性條件下Na反應后變?yōu)镠，酚羥基也能與聚酰胺結合而被吸附，但是在甲醇有機相存在的條件下，和聚酰胺的結合并不緊密，容易溶解在甲醇中隨著(zhù)淋洗液流出，導致洗脫回收率低且不穩定。通過(guò)設計淋洗和不淋洗步驟進(jìn)行結果比較，發(fā)現不淋洗時(shí)赤蘚紅的回收率大約93%，明顯高于淋洗時(shí)赤蘚紅的回收率80%左右。因聚酰胺在用于合成著(zhù)色劑測定時(shí)淋洗可以除掉一些干擾分析的雜質(zhì)成分，故淋洗步驟很有必要，如果赤蘚紅和其它合成著(zhù)色劑同時(shí)用聚酰胺小柱分析時(shí)，需要關(guān)注淋洗溶液和基質(zhì)的復雜程度，決定是否需要在淋洗液中加入甲醇有機試劑。

除了用聚酰胺小柱測定赤蘚紅時(shí)淋洗溶液不能用甲酸-甲醇溶液外，要使赤蘚紅的實(shí)驗結果準確、回收率高還需要注意另外兩個(gè)方面的問(wèn)題：

（1）上機之前過(guò)濾所用的濾膜不得使用尼龍濾膜，因為尼龍的化學(xué)成分就是聚酰胺，會(huì )吸附合成著(zhù)色劑；

（2）建議赤蘚紅上機溶液的溶劑中加入一定比例的甲醇，如甲醇：水（1：1）或甲醇：0.02M乙酸銨（1：1），而非用純水做溶劑。因為我們多次實(shí)驗發(fā)現經(jīng)過(guò)氮吹濃縮后，純水復溶，管壁上會(huì )殘留很多肉眼可見(jiàn)的赤蘚紅（紅色），經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間的超聲、渦旋都很難溶解掉，上機分析回收率大約才20%左右，但加入一定比例的甲醇后很容易將赤蘚紅溶解下來(lái)，且甲醇本來(lái)也是流動(dòng)相的一部分，用流動(dòng)相做溶劑合情合理。