干貨丨且看如何利用梯度洗脫方法一招破解出峰問(wèn)題--原理篇

我們先來(lái)看一張圖

通過(guò)一張直觀(guān)的圖來(lái)探討今天的話(huà)題

這三張色譜圖的條件如下：

測試物質(zhì)為C1-C10的烷基胺同系列衍生的衍生的亞奈基苯并咪唑胺黃酰

這三張色譜圖給您的直觀(guān)感覺(jué)是什么？

●A圖等度洗脫，95：5的甲醇水，10個(gè)峰在10min出峰，峰很尖銳（窄），可是基線(xiàn)不分離。

●B圖等度洗脫，80：20的甲醇水，10個(gè)峰在50min出峰，后面的峰明顯展寬，峰矮胖。

●C圖梯度洗脫，所有物質(zhì)在20min出峰，分離度和響應都良好。

這三張圖看完后，您是否有如下疑問(wèn)？

●等度洗脫，要么幾個(gè)峰分不開(kāi)，要么分開(kāi)了，時(shí)間長(cháng)，出現矮胖峰，等度洗脫不適合多組分分離嘛，同行告訴我多組分一般要使用梯度洗脫，這是為什么？

●梯度洗脫是怎么實(shí)現化合物在好的分離度下，又保持色譜峰不展寬，出現尖銳的色譜峰的？

●怎么設置梯度，怎么確定一個(gè)好的梯度洗脫方法？

為了解決大家的困惑，

我們今天就是要來(lái)探討，

為什么多組分要使用梯度法，

梯度洗脫怎么優(yōu)化。

對于多組分的檢測，我們希望什么？

1、良好的分離度

2、好的響應，峰高和峰面積，色譜不展寬，得到窄的色譜峰。

首先，我們來(lái)看看影響色譜分離度的因素是什么？

這里給大家放上一個(gè)分離度的關(guān)系式：

式子中的R為分離度，k為容量因子，a為分離因子。

我們來(lái)回顧一下基本知識：

t_M 為不被固定相保留的死時(shí)間，

t_R為化合物的保留時(shí)間（從進(jìn)樣到出現濃度大值的時(shí)間），

t_R^’為化合物的調整保留時(shí)間。

容量因子：是化合物在液-固兩相達到分配平衡時(shí)，組分在固定相與流動(dòng)相中的質(zhì)量比值，因此又被稱(chēng)為質(zhì)量分配系數。

分離因子：分離因子是在同一色譜系統條件下保留的差異的量度

當α=1時(shí)，兩個(gè)色譜峰具有相同的保留時(shí)間并共流出。

對于多組分，我們需的是，在一定的時(shí)間內將組分分離，并且得到一定的色譜寬度的峰（尖峰）；那么想要良好的分離度，需要的是相鄰的兩個(gè)化合物能達到基線(xiàn)分離，首先看一下分離度公式，看看什么影響分離度：

其中：；我們可以看到，在同一色譜系統，兩個(gè)化合物的分離因子，與此色譜系統下，化合物自身特性相關(guān)，當α越大，分離度也將越大。

而其中：

可見(jiàn)，K’增大，可以提高分離度。

我們知道，梯度洗脫程序在改變流動(dòng)相的比例，以達到分離的目的，那么梯度洗脫究竟是怎么來(lái)影響分離度的呢？

我們以反相色譜系統為例，來(lái)看一下，當我們改變了流動(dòng)相比例時(shí)，k’的變化情況。

這是一張反相色譜圖中，化合物的lgk’與流動(dòng)相中有機相比例的關(guān)系圖，近似為線(xiàn)性的關(guān)系圖。從這張圖，可以看出，在反相色譜中，lgk’隨著(zhù)ψ比例增大，逐漸降低，k’也逐漸減小。

即:  lgk’ =Aψ+B (A為曲線(xiàn)的斜率，B為截距）。

通過(guò)這張圖，我們來(lái)說(shuō)明為什么需要梯度洗脫，

對于化合物1，2

Ψ=0.45時(shí)，lgk1’ =0.97，k1’=9.33；

lgk2’=1.27,   k2’=18.6;

如果我們使用等度洗脫，有機相的比率為45%，我們會(huì )發(fā)現，由于此時(shí)的k1’=9.33， k2’=18.6，k’都大于10，這個(gè)時(shí)候，化合物與固定相作用的時(shí)間較長(cháng)，因此可以想象，在這個(gè)時(shí)候化合物1，和化合物2 出峰時(shí)間都比較靠后，而且由于強的作用力，導致流動(dòng)相無(wú)法在一個(gè)短的時(shí)間內將化合物洗脫出來(lái)，因此峰都變得比較矮胖，也就是寬峰，如圖：

對于化合物1，2

Ψ=0.65時(shí)，lgk1’ =-0.21，k1’=0.61；

lgk2’=-0.35,   k2’=0.44;

如果我們使用等度洗脫，有機相的比率為65%，我們會(huì )發(fā)現，由于此時(shí)的k1’=0.61， k2’=0.44，k’都接近于0，此時(shí)化合物會(huì )被流動(dòng)相快速帶出，形成尖峰，但由于兩個(gè)化合物得K'都很小，而且接近，會(huì )形成共流出物，而且，第yi個(gè)峰出峰時(shí)間hao大于2t_M（K’=0)值，反映得圖如下：

那么如果是梯度洗脫，會(huì )怎么樣呢：

在梯度洗脫過(guò)程中，K’的值會(huì )隨流動(dòng)相的變化而改變，化合物被流動(dòng)相洗脫帶出色譜柱到達檢測器的保留時(shí)間，與化合物從進(jìn)樣開(kāi)始，到流出色譜柱的這一段時(shí)間內平均的K’的大小，以及色譜柱長(cháng)，流動(dòng)相的流速等有關(guān)，而化合物是否能產(chǎn)生窄的色譜峰，則取決于物質(zhì)在將要脫離色譜柱的時(shí)候，K’能否比較?。磁c固定相的作用力足夠小，能被快速沖洗出去）。

打一個(gè)比方：

一輛汽車(chē)和一輛摩托車(chē)，通過(guò)一個(gè)長(cháng)度為L(cháng)km的隧道，汽車(chē)初始速度為20Km/h，摩托車(chē)的初始速度為35km/h,汽車(chē)的加速度為1.5m/s²，摩托車(chē)的加速度為0.8m/s²，那么誰(shuí)將先通過(guò)隧道，汽車(chē)能否實(shí)現超車(chē)？

其實(shí)如果隧道足夠短，由于初始由于摩托車(chē)速度快，雖然加速度小，但是汽車(chē)整體的移動(dòng)速度仍然小于摩托車(chē)，汽車(chē)的平均速度就小于摩托車(chē)的速度，在這個(gè)整體水平上，汽車(chē)就會(huì )比摩托車(chē)慢到達，例如：當L=100m時(shí)，汽車(chē)通過(guò)的時(shí)間為8.42S，摩托車(chē)通過(guò)的時(shí)間為7.78S。

相反，如果隧道足夠長(cháng)，那么汽車(chē)在這段距離上的平均車(chē)速就比摩托車(chē)快，那么汽車(chē)就能實(shí)現彎道超車(chē)，例如當L=1000m時(shí)，通過(guò)隧道的時(shí)間，摩托車(chē)為39.3S；而汽車(chē)為33S。

這個(gè)比方里面的長(cháng)為L(cháng)的隧道（不同的隧道長(cháng)度反映了車(chē)子通過(guò)隧道的加速時(shí)間的長(cháng)短，導致終通過(guò)隧道的平均速度不一樣），這個(gè)就相當于色譜柱長(cháng)，初始速度就相當于初始流動(dòng)相比例下的化合物的K’，加速度就相當于lgK’與ψ線(xiàn)性曲線(xiàn)的曲線(xiàn)斜率，我們通常說(shuō)色譜柱柱子長(cháng)度是一定的，流動(dòng)相在梯度變化的過(guò)程中，在這個(gè)時(shí)間段內，那么相同的柱子長(cháng)度，K’變化的速率不同（就如同車(chē)子的加速度一樣），在整個(gè)色譜行為上的平均值K’（如同車(chē)子在通過(guò)隧道的平均速度V’），就不一樣，如果在梯度變化的時(shí)間范圍內，通過(guò)相同的色譜柱，K’的平均值越小，就越容易先被洗脫出色譜柱，因此我們不能光關(guān)注化合物的初始K’，還需要關(guān)注化合物的K’的變化速率，這就很好的解釋了，為什么有的物質(zhì)在同一根色譜柱上，在A(yíng)梯度時(shí)，化合物X比化合物G先出峰，而在另外一個(gè)梯度時(shí)，卻是G先出峰（形勢發(fā)生了逆轉）。終誰(shuí)先出峰，與這些因素有關(guān)，另外當接近隧道出口時(shí)，若汽車(chē)速度加到越快（相對于化合物的K’越?。?，那么汽車(chē)或者摩托車(chē)整體通過(guò)隧道的時(shí)間就越短（t=車(chē)身長(cháng)度/車(chē)速），對應于此時(shí)化合物出峰的色譜峰寬度就越窄。

例如，車(chē)身長(cháng)為2.5m，如果終通過(guò)隧道時(shí)車(chē)速為23m/s,則汽車(chē)*通過(guò)隧道的時(shí)間為：0.10S，如果這時(shí)候車(chē)速為15m/s，則汽車(chē)*通過(guò)隧道的時(shí)間為：0.16S，我們看到，出隧道時(shí)，車(chē)速越快，車(chē)子通過(guò)隧道的時(shí)間越短，反映在色譜上，就是峰的寬窄了。色譜峰流出的峰寬度反映在色譜圖上的寬度即t₁-t₀。

總結

1、對于容量因子K’范圍很大的化合物組，分離可以?xún)?yōu)先考慮梯度洗脫。

2、多組分的分離策略，考慮合適的分析時(shí)間內，得到窄峰和好的分離度

3、梯度洗脫是利用變化的有機相比例，即強度不同，達到改變化合物在兩相中的作用力大小。

4、lg K’與ψ近似線(xiàn)性關(guān)系

5、K’隨ψ的變化趨勢的不同，使得梯度洗脫將不同化合物在色譜上的保留時(shí)間差異拉大，甚至出現超車(chē)。

6、K’≈0時(shí)，化合物幾乎與固定相無(wú)作用力，能快速通過(guò)色譜柱，產(chǎn)生尖峰。