37種脂肪酸甲酯分離的小秘密，你知道嗎？

     CNW CD-2560色譜柱可完美適用于食品中脂肪酸的檢測（GB 5009.168-2016 食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定，GB 5009.257-2016 食品安全國家標準 食品中反式脂肪酸的測定），可實(shí)現37種脂肪酸甲酯的有效分離。

     經(jīng)常有檢測人員反饋之前用CD-2560可很好的分離37種脂肪酸甲酯，但使用一段時(shí)間后分離度突然變差了，尤其是23、24號峰或者31、32號峰；也有檢測人員反映之前用其他品牌的色譜柱可分好，換用CD-2560就分不好了。

其實(shí)這可能并不是色譜柱的質(zhì)量問(wèn)題，

那到底是什么原因呢？

讓小編帶你一探究竟。

     我們實(shí)驗室對不同流速條件下，CD-2560對37種脂肪酸甲酯混標的分離情況做了對比，實(shí)驗的色譜條件為：

色譜柱：CD-2560，100m*0.25mm*0.20μm

進(jìn)樣口：250℃

分流比：30：1

進(jìn)樣量：1μL

升溫程序：初始溫度140℃，保持5min，以4℃/min的速率升至240℃，保持30min。

FID檢測器溫度：260℃

實(shí)驗得到的譜圖如下：

     從以上幾張色譜圖中，我們可以看出，不同的流速對一些脂肪酸甲酯的出峰情況會(huì )有很大的影響，尤其是31號峰（順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯）和32號峰（二十三碳酸甲酯）。對于本次實(shí)驗所用的色譜柱，在0.80mL/min的流速條件下，31號和32號峰可以看到明顯分離，而在0.70mL/min的流速條件下分離度則變的很差，在0.65mL/min的流速條件下兩個(gè)峰則直接變成了一個(gè)峰，繼續降低流速，在0.4mL/min的流速時(shí)，又發(fā)現兩個(gè)峰又分開(kāi)了，但此時(shí)兩個(gè)峰的出峰時(shí)間則進(jìn)行了顛倒，31號峰為二十三碳酸甲酯，而32號峰為順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯。

這個(gè)現象很有意思，是為什么呢？

     我們從色譜分離的基礎理論來(lái)找找原因。塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素，塔板理論引入了塔板數和塔板高度作為柱效的衡量指標，不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數不同，分配系數的差異是所有色譜分離的實(shí)質(zhì)性原因，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時(shí)，應指明測定物質(zhì)。速率理論，即范第姆特方程式：H = A + B/u + C·u（其中A為渦流擴散項，u為流動(dòng)相平均線(xiàn)速度，B/u為分子擴散項，C·u為傳質(zhì)阻力項），組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展、柱效下降的主要原因，通過(guò)選擇適當的固定相粒度、載氣種類(lèi)、液膜厚度及載氣流速可提高柱效，速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。

     分配系數的差異是所有色譜分離的實(shí)質(zhì)性原因，在色譜圖上兩個(gè)目標峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數決定而不是擴散速度，分配系數差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離，分配系數是由組分的熱力學(xué)因素決定的；而擴散速度是動(dòng)力學(xué)因素，反映在色譜流出曲線(xiàn)上即為色譜峰的區域寬度。當兩組分的分配系數K相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數多大，都無(wú)法分離。

     分配系數的定義為在一定的溫度和壓力下，組分在兩相之間達到分配平衡時(shí)的濃度比，即K=Cs/Cm（Cs為組分在固定相中的濃度，Cm為組分在流動(dòng)相中的濃度）；分配比為在一定的溫度和壓力下，組分在兩相之間達到分配平衡時(shí)的質(zhì)量比，即k=Ms/Mm =K·Vs/Vm。分配系數和分配比與組分和固定液的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，隨柱溫和柱壓的變化而變化。經(jīng)滯留因子和保留時(shí)間的計算公式，可推得分配比的計算公式k=(tR-tm)/ tm，式中tR為組分的保留時(shí)間，tm為色譜柱的死時(shí)間。

     不同的色譜柱流速，會(huì )導致壓力的變化，進(jìn)而導致分配系數變化。對不同的目標化合物因其分子結構和空間構型等的不同，導致其熱力學(xué)性質(zhì)也有所不同，其分配系數不同，而在不同的壓力變化情況下，因熱力學(xué)性質(zhì)的差異，也會(huì )導致其分配系數變化的差異性。對我們這次實(shí)驗中的31號和32號峰，在0.8mL/min流速下，二十三碳酸甲酯的分配比大于順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯，因此二十三碳酸甲酯的保留時(shí)間大于順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯；流速減小到0.65mL/min時(shí)，因為流速的變化以及這兩種化合物自身的熱力學(xué)性質(zhì)，導致此色譜條件下二十三碳酸甲酯的分配比等于順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯，因此兩者無(wú)法分離；流速繼續減小到0.4mL/min時(shí)，二十三碳酸甲酯的分配比反而變得小于順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯，因此二十三碳酸甲酯的保留時(shí)間小于順-5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯。正是因為不同流速條件下，各種脂肪酸甲酯的分配系數變化不同，導致這些脂肪酸甲酯在不同流速條件下呈現出不同的分離情況，而且不同的脂肪酸甲酯可能呈現相反的變化趨勢。

     下表為在不同流速條件下一些脂肪酸甲酯的分離度變化情況，從表中可看出，有些脂肪酸甲酯隨著(zhù)流速增加分離度也隨之增加，但也有些目標物隨流速的增加分離度隨之減小。32號峰如我們上邊所說(shuō)，分離度隨著(zhù)流速變大先變小后逐漸變大；而24號峰、30號峰和35號峰則隨著(zhù)流速的變大分離度逐漸變小。這種變化就導致了我們需要找到一個(gè)適中的流速，以保證CD-2560色譜柱可以對多種脂肪酸甲酯均有較好的分離度，而不同品牌的色譜柱，不同批次的色譜柱，或者色譜柱使用時(shí)間較長(cháng)，可能會(huì )使色譜柱的固定液有細微的不同，也有可能不同的儀器性能也有所差別，這些都可能導致色譜柱柱效以及分配系數的不同，色譜柱所需的you流速也會(huì )發(fā)生變化，因此需要我們微調流速以得到you的分離度，本次實(shí)驗所用的CD-2560色譜柱you流速為0.85mL/min，在此流速下，37種脂肪酸甲酯的分離度均在1.25以上。

表1 不同流速條件下脂肪酸甲酯的分離度

     備注：表中0.40mL/min和0.45mL/min流速條件下31號和32號峰目標物出峰順序顛倒，31號為C23:0，32號為C20:4n6；0.5-0.65mL/min流速條件下，C20:4n6和C23:0合并為一個(gè)峰。

     安譜實(shí)驗建議您如果遇到37種脂肪酸甲酯分離度變差的情況，不要急，先看下是哪些峰變差了，如果僅是上述的幾組峰變差，而其他目標物的峰型和分離度沒(méi)什么變化，則應該就不是色譜柱壽命到了，建議先在0.8mL/min的流速條件下查看目標峰的分離情況，然后根據上述的理論，如果是31號和32號峰分離變差就增加流速，如果是24號峰、30號峰和35號峰分離變差就減小流速，通過(guò)流速的微調以找到you的分離條件。

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