SPE經(jīng)典案例分析——在方法偏離的情況下如何對實(shí)驗過(guò)程進(jìn)行有效優(yōu)化

大家好，

又到了我們每周一的干貨時(shí)間。

大家還記得第yi期干貨

嗎？

文中仔細分析了在SPE的基本操作階段中

引發(fā)流速慢這類(lèi)問(wèn)題的主要原因。

今天我們主要給大家分享一下，

在方法偏離的情況下,

如何對實(shí)驗過(guò)程進(jìn)行有效優(yōu)化。

在實(shí)驗過(guò)程中，我們經(jīng)常遇到方法偏離。方法偏離主要是發(fā)生在人機料法環(huán)測這幾個(gè)方面。實(shí)驗中經(jīng)常遇到的樣品量不同，前處理儀器不同這些都是很常見(jiàn)的偏離問(wèn)題。那么在面對這樣的問(wèn)題的時(shí)候，我們該怎樣對于整個(gè)樣品前處理過(guò)程的產(chǎn)生一個(gè)合理分析并對實(shí)驗步驟進(jìn)行有效的優(yōu)化調整呢？

今天我們給大家分享一個(gè)案例，通過(guò)這個(gè)案例，希望對您的實(shí)驗有所啟發(fā)。

這個(gè)案例來(lái)自我們的客戶(hù)A?？蛻?hù)A是做雪碧里合成著(zhù)色劑檢測。參考標準是GB 5009.35-2016《食品安全國家標準 食品中合成著(zhù)色劑的測定》。這個(gè)標準適用于飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著(zhù)色糖衣制品中合成著(zhù)色劑的測定，標準中用聚酰胺粉末吸附法或液液萃取分配法提取食品中人工合成著(zhù)色劑，將其制成水溶液，再用高效液相色譜儀分析。這個(gè)國標的檢測方法比較繁瑣，并且赤蘚紅不能與其他色素一起測定，應用到實(shí)際檢測時(shí)，很多老師都覺(jué)得實(shí)驗過(guò)程過(guò)于復雜，難于操作。

針對這個(gè)國標，安譜實(shí)驗對其方法進(jìn)行了優(yōu)化，并且成功開(kāi)發(fā)了食品中合成著(zhù)色劑檢測小柱。采用高效液相色譜法來(lái)同時(shí)檢測食品中8種合成著(zhù)色劑（莧菜紅、新紅、赤蘚紅、胭脂紅、日落黃、檸檬黃、亮藍，靛藍），方法簡(jiǎn)單易行，且回收率高，深受廣大用戶(hù)的歡迎。

案例中的客戶(hù)A就是使用安譜實(shí)驗的合成著(zhù)色劑小柱（SBEQ-CA73-GBT5009.35）來(lái)實(shí)驗的?？蛻?hù)在20g的雪碧樣品里面加20ul,1000ug/ml的色素混標，采用全自動(dòng)固相萃取儀按照安譜實(shí)驗合成著(zhù)色劑柱的實(shí)驗方法中SPE的洗脫程序運行，結果發(fā)現亮藍在的回收率不佳?？蛻?hù)希望我們能幫忙優(yōu)化下實(shí)驗方法。

面對客戶(hù)對實(shí)驗步驟優(yōu)化的訴求，我們仔細分析了客戶(hù)目前的實(shí)驗方法。

根據表格中兩種方法的對比，可以看出客戶(hù)和安譜實(shí)驗合成著(zhù)色劑柱方法主要不同點(diǎn)是樣品量不同而帶來(lái)的。一是客戶(hù)是按照國標的取樣要求，需要20g的樣品。而我們實(shí)驗單頁(yè)的樣品取樣量則為1g，具體到上樣量，客戶(hù)的上樣量是約23ml，而我們的上樣量約12ml?？蛻?hù)的上樣量約為我們的2倍，二是客戶(hù)的淋洗液和洗脫液也根據上樣量而都擴大了2倍。后就是客戶(hù)是用自動(dòng)固相萃取裝置進(jìn)行SPE操作的，和手動(dòng)的固相萃取方法在流速控制上還是有差異的。由此可見(jiàn)，客戶(hù)的方法偏離主要體現在樣品取樣量，溶劑體積以及所用的儀器上。

客戶(hù)反饋實(shí)驗結果亮藍的回收率不佳，希望能夠改善亮藍的回收率。針對客戶(hù)的訴求，我們應該有如下思路來(lái)解決這個(gè)回收率的問(wèn)題。

1  確定目標化合物主要損失步驟

亮藍的回收率不佳，說(shuō)明亮藍在洗脫前的實(shí)驗過(guò)程中有損失。針對這種情況，我們需要先確定亮藍的主要損失步驟。

這里我們可以引入SPE操作過(guò)程中一個(gè)非常實(shí)用的實(shí)驗技巧——分步收集。

分步收集就是通過(guò)收集上樣液，淋洗液，洗脫液,并上機分析，從而判斷目標化合物具體損失的環(huán)節，明確實(shí)驗步驟中具體需要優(yōu)化的環(huán)節。

根據我們的建議，客戶(hù)先實(shí)施了分步收集，發(fā)現亮藍在上樣液中未被檢出，淋洗環(huán)節有檢出。說(shuō)明亮藍在小柱上能夠很好的被吸附，所以上樣液中無(wú)亮藍。但是在淋洗的時(shí)候被洗脫下來(lái)，所以淋洗部分是亮藍回收率損失的主要部分。

2  分析目標化合物主要損失的原因

通過(guò)前面分步收集，我們發(fā)現客戶(hù)的樣品中亮藍的主要是在淋洗過(guò)程中損失的。那么接下來(lái)就需要根據實(shí)驗原理分析亮藍損失的原因。

合成著(zhù)色劑小柱的填料可與酚類(lèi)、酸類(lèi)、蒽醌類(lèi)等成分形成氫鍵，因而產(chǎn)生吸附作用。合成著(zhù)色劑的分子結構中帶有磺酸基團，羥基等。故能在酸性溶液中能與人工合成色素形成氫鍵牢固地結合，從而與天然色素、蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等物質(zhì)分離。然后在堿性條件下能夠解吸色素。但填料對天然色素的吸附并不不緊密，天然著(zhù)色劑在酸性條件下能夠被去除。所以在我們的實(shí)驗過(guò)程中，會(huì )用甲醇-甲酸-水溶液去淋洗小柱，去除天然色素的干擾。

根據實(shí)驗原理我們不難發(fā)現，淋洗的目的主要是去除天然色素的干擾。而我們的目標化合物亮藍是一種易溶于水的合成著(zhù)色劑。不難發(fā)現，在這種情況下，淋洗溶液和亮藍之間也會(huì )存在一定的分子間作用力，當淋洗液體積達到一定程度的時(shí)候，極易溶于水的亮藍就容易被淋洗液淋洗下來(lái)。

3  提出合理的改進(jìn)意見(jiàn)

根據前面的步驟我們發(fā)現淋洗液和目標化合物亮藍之間的分子間作用力可能是造成亮藍損失的主要原因。那么在這種情況下我們需要怎樣改進(jìn)實(shí)驗過(guò)程呢？針對這個(gè)案例我們考慮到客戶(hù)基質(zhì)是碳酸飲料雪碧，本身基質(zhì)中成分比較簡(jiǎn)單。而淋洗的目的主要是去除天然色素，所以在對于雪碧這種基質(zhì)而言淋洗這一步并不是關(guān)鍵步驟，可以減少用量。建議將10ml的淋洗液體積降至5ml，并且適當降低流速。

4  實(shí)驗驗證

客戶(hù)根據我們的建議改進(jìn)實(shí)驗條件后，發(fā)現亮藍在淋洗時(shí)不再被洗脫下來(lái)，回收率能達到實(shí)驗要求。

根據上面的案例分析，我們不難發(fā)現，在面對實(shí)際檢測工作中的方法偏離問(wèn)題時(shí)，我們需要做的是冷靜的比較方法的主要偏離點(diǎn)，并明確目標化合物的主要損失步驟，經(jīng)過(guò)仔細思考，大膽推測，認真實(shí)驗驗證找到解決問(wèn)題的方向。

路漫漫其修遠兮，

吾將上下而求索。

實(shí)驗過(guò)程本身就是不斷探索創(chuàng )新的過(guò)程，

遇到困難和問(wèn)題不用慌張，

安譜實(shí)驗一直在您身邊，

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